Composição da matriz extracelular do ligamento cardinal de mulheres na pós-menopausa com e sem prolapso uterino

O prolapso uterino tem sua incidência aumentada na pós-menopausa. O objetivo deste estudo é identificar as alterações na matriz extracelular do ligamento cardinal associadas à menopausa e ao prolapso uterino. Ligamento cardinal de três diferentes grupos de mulheres, pré-menopausa, prolapso uterino e pós-menopausa, foram identificados e biopsiados durante 57 histerectomias abdominais ou vaginais. As amostras foram processadas por métodos bioquímicos para caracterização e quantificação de glicosaminoglicanos sulfatados e colágeno. As concentrações relativas de glicosaminoglicanos foram obtidas por eletroforese. Procedimentos histológicos foram feitos para identificar fibras elásticas (Weigert), distribuição de colágeno (Picro Sirius) e decorin (imunohistoquímica). Nossos resultados mostraram aumento na concentração de GAG de 72,2%, redução na concentração de colágeno de 37% e diminuição de 22% de fibras elásticas no grupo de prolapso uterino quando comparado ao grupo da pós-menopausa (p<0,05, p<0,04 e p<0,05 respectivamente). As concentrações relativas de glicosaminoglicanos sulfatados para condroitin sulfato, heparan sulfato e dermatan sulfato não mostraram diferenças entre os três grupos. A organização do colágeno foi similar entre os três grupos e a marcação do decorin pareceu estar diminuída no grupo de prolapso uterino. Nossos resultados indicam alterações no metabolismo do tecido conjuntivo. O ligamento cardinal da mulher na pós-menopausa possui uma matriz extracelular mais densa. Esta alteração não ocorre na mulher com prolapso uterino.

Análise de polimorfismos e de expressão do gene p16INK4a em neoplasias cervicais

O câncer de colo do útero é o segundo carcinoma mais frequente em mulheres no mundo e um dos cânceres femininos mais incidentes no Brasil. Em lesões pré-malignas e malignas do colo uterino, a proteína p16INK4a, que participa do controle do ciclo celular, apresenta um aumento considerável de sua expressão, devido possivelmente à presença de oncoproteínas do papilomavírus humano (HPV). Dois polimorfismos no gene p16INK4a, p16 500C>G e p16 540C>T, estão localizados na região 3 não traduzida (3UTR), que está envolvida na regulação pós-transcricional da expressão gênica. O objetivo deste estudo foi avaliar possíveis associações entre os polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T e o desenvolvimento de neoplasias cervicais e/ou a severidade das lesões, considerando os níveis de expressão da proteína p16INK4a nas lesões cervicais e certos fatores de risco clássicos para o câncer cervical, incluindo a infecção pelo HPV. Para isso, foram selecionadas 567 mulheres residentes no Rio de Janeiro, 319 com citologia cervical alterada (grupo de casos) e 248 sem história prévia de alteração citológica do colo uterino (grupo de comparação). Amostras de sangue periférico de todas as participantes foram utilizadas na análise molecular dos polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T através da técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), usando as enzimas de restrição MspI e HaeIII, respectivamente. A expressão da proteína p16INK4a em 137 biópsias de mulheres pertencentes ao grupo de casos foi avaliada por imunohistoquímica. A detecção de DNA do HPV em células cervicais foi feita em todas as amostras do grupo de comparação e em 194 amostras do grupo de casos pela técnica de PCR, usando dois pares de oligonucleotídeos, MY09/MY11 e GP05+/GP06+. Os dois grupos de estudo se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg. As distribuições genotípicas para p16 500C>G e p16 540C>T e as distribuições de combinações haplotípicas nos dois grupos não apresentaram diferenças significativas. A análise do subgrupo HSIL+câncer (casos com lesão intraepitelial de alto grau ou carcinoma invasivo) em comparação com o subgrupo LSIL (casos com lesão intraepitelial de baixo grau) revelou diferença significativa entre as distribuições das combinações haplotípicas (p = 0,036) e diferenças marginais entre as distribuições genotípicas para p16 500C>G (p = 0,071) e p16 540C>T (p = 0,051). O alelo p16 540G, em heterozigose ou homozigose (OR = 1,91, IC 95% = 1,08-3,37), e a combinação haplotípica p16 500C-540C 500G-540C (OR = 2,34, IC 95% = 1,202-4,555) mostraram-se associados com a severidade da lesões cervicais. Já o genótipo p16 540T/T (OR = 0,25, IC 95% = 0,08-0,79), e a combinação haplotípica p16 500C-540T 500C-540T (OR = 0,27, IC 95% = 0,088-0,827) exibiram papel protetor contra o desenvolvimento de lesões mais severas. As análises de interação entre os polimorfismos de p16INK4a e a expressão de p16 ou a infecção pelo HPV foram comprometidas pelo número reduzido de amostras analisadas. Não se observou qualquer interação entre os polimorfismos estudados e os fatores de risco clássicos para o câncer de colo uterino. Nossos resultados apontam para a importância dos polimorfismos do gene p16INK4a como marcadores de severidade da neoplasia cervical.

Efeitos do uso de antiinflamatório e do exercício aeróbico sobre a regeneração tecidual e perfil biomecânico do tendão calcâneo de ratos após ruptura completa

Ruptura do tendão calcâneo é uma das lesões tendíneas mais frequentes. Embora a maioria dos trabalhos sugira que o exercício seja benéfico na cicatrização tendínea, não há consenso sobre o efeito do antiinflamatório neste contexto. Trabalhos experimentais tentam reproduzir lesão aguda deste tendão, em diferentes espécies animais. Neste estudo, descrevemos uma técnica de tenotomia completa do tendão calcâneo direito em ratos e, em seguida, avaliamos os efeitos do uso do antiinflamatório e do exercício aeróbico, isoladamente e em combinação, sobre a proliferação celular e o perfil biomecânico do tendão calcâneo, durante o processo de cicatrização após tenotomia. Estudo experimental com 156 ratos machos adultos, da raça Wistar, com idade média de 3 meses e peso médio de 300g. Após anestesia com tiopental e com auxílio da microscopia de luz, foi realizada incisão longitudinal posterior de cinco milímetros, em direção proximal, a partir da tuberosidade posterior do calcâneo da pata direita do rato. Foi feito corte transversal do tendão calcâneo, a sete milímetros da tuberosidade do calcâneo, com preservação do tendão plantar. Utilizamos as técnicas de Hematoxilina e Eosina, Picrosirius-red e Resorcina-fucsina de Weigert para avaliação da cicatrização tendínea e das fibras dos sistemas colágeno e elástico. Após a tenotomia, metade dos animais receberam tenoxicam intramuscular por 7 dias e no 8o dia iniciou-se protocolo de exercício em esteira na metade de cada grupo. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de tratamento: A sem antiinflamatório E sem exercício (controle); B com antiinflamatório E com exercício; C sem antiinflamatório E com exercício; D com antiinflamatório E sem exercício. Os animais foram eutanasiados com 1, 2, 4 e 8 semanas após a tenotomia, para avaliação histológica pelo PCNA, e biomecânica através do teste de resistência à tração e da medida do ciclo locomotor. Foram realizados análise de variância, teste de Kruskal-Wallis e o método de Bonferroni, no programa R Project, versão 2.11.1. O tempo cirúrgico médio foi de 1 minuto e 24 segundos, sem complicações observadas até a 8a semana pós-operatória. Observamos proliferação celular e fibrilogênese com duas semanas, e diminuição da celularidade e das fibras elásticas na 8a semana, além de mudanças na organização estrutural do sistema colágeno. Encontramos pico da imunomarcação com PCNA na 2a semana em todos os grupos, exceto no grupo A, cujo pico aconteceu com 1 semana da tenotomia. Evidenciamos resistência à tração significativamente maior (p=0,02) nos ratos submetidos ao exercício, 8 semanas após ruptura. Nos grupos com antiinflamatório, observamos um ciclo locomotor mais estável durante todo o tempo avaliado. Consideramos a técnica cirúrgica experimental de tenotomia completa do tendão calcâneo, realizada com auxílio da microscopia de luz e preservação do tendão plantar, simples, rápida, com sinais de cicatrização tendínea normal e de fácil reprodução em ratos. O exercício aeróbico, iniciado precocemente após tenotomia completa do tendão calcâneo, é significativamente benéfico na sua recuperação biomecânica e o uso combinado com antiinflamatório confere maior estabilidade na marcha, o que pode proteger contra rerruptura tendínea em ratos

Modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a modulação celular na regeneração da fratura óssea padronizada em tíbia de ratos

O propósito do presente trabalho foi investigar a participação da proliferação celular e da expressão dos componentes da matriz extracelular na cascata de eventos do processo de reparo da fratura óssea, empregando as técnicas histológica, imunohistoquímica e morfométrica, em um modelo experimental padronizado para a indução da lesão na tíbia de ratos a partir do método empregado por Yuehuei e Friedman7. É importante padronizar um modelo de indução da fratura, para posterior investigação da participação das células e dos componentes da matriz extracelular no processo de reparo da fratura, considerando que o tempo de consolidação depende significantemente da natureza e do tipo da lesão produzida. Quarenta (n = 40) ratos Wistar foram submetidos a fratura . Os animais foram avaliados em oito (n = 8) grupos de cinco (n = 5) animais, cada grupo emperimental com 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 e 240 horas após a fratura (12h até 10 dias). As fraturas foram classificadas de acordo com o sistema de classificação internacional de fratura de Muller100, AO (Associação para Osteosíntese). Foram encontradas fraturas simples em 86% do total, sendo 68% de fraturas transversas e 18% de fraturas obliquas, 14% do total de fraturas foram complexas, sendo 8% de fraturas irregulares e 6% de fraturas segmentares. Esses resultados demonstram que o aparelho permite padronizar radiológicamente o tipo de fratura, caracterizado pela linha que separa os fragmentos ósseos. Os resultados qualitativos dos componentes da matriz extracelular para TGF-β, VEGF, colágeno I e II, osteopontina, proteoglicanos, fibras do sistema elástico com a coloração de resorcina funcsina de Weigert, e para proliferação celular pelo PCNA, assim como os resultados morfométricos, sugerem que a modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a proliferação celular durante o processo de reparo da fratura não é homogênea para todos os componentes teciduais, dependendo significantemente das tensões locais geradas pelo tipo da linha de fratura que pode ser determinante no tempo de regeneração do osso e na qualidade da restauração das propriedades biomecânica. Nossos achados podem contribuir para melhor compreensão da reparo de fratura óssea e para novas abordagens terapêuticas que considerem as propriedades biomecânicas do tecido ósseo em reparo nas suas diferentes etapas

Análise molecular e morfométrica da próstata ventral de ratos injetados com leptina

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da administração de leptina no lobo ventral da próstata de ratos adultos. Vinte ratos Wistar machos e adultos foram divididos em 2 grupos: L - animais foram injetados com 50 μL diária de leptina (8 μg / 100 g PC, subcutânea) durante quatro dias e C - animais receberam o mesmo volume de solução salina. Perfil lipídico e níveis séricos de testosterona foram avaliados. O lobo ventral da próstata foi processado para análise histomorfométrica. Expressão dos genes da aromatase, receptor de andrógeno, receptores de estrógeno (α e β) e as isoformas dos receptores de leptina longa (Ob-Rb) e curta (Ob-Ra) foram avaliados por PCR em tempo real. Proliferação celular foi avaliada por imuno-histoquímica com PCNA. Os dados foram expressos como média  erro padrão e analisados pelo teste t de Student. Níveis séricos de colesterol aumentaram (C = 39,7 4,2; L = 55,2 4,2, mg / dL, P ≤ 0,02) e de testosterona (C = 1,6 0,43; L = 0,6 0,15, ng / dL, P ≤ 0,03) diminuíram no grupo L. A análise histomorfométrica mostrou uma redução na densidade de células (C = 8868 242; L = 8.211 210, mm2; P ≤ 0,04), na área total (C = 0,24 0,026; L = 0,10 0,009, mm2; P ≤ 0,001) e na área interna dos ácinos (C = 0,16 0,009; L = 0,08 0,006, mm2; P ≤ 0,0002). Por outro lado, houve um aumento na altura do epitélio (C = 17,3 0,3; L = 22,8 0,2 m, P ≤ 0,0001) e no número de ácinos (C = 7,0 0,2; L = 8,7 0,1, mm2; P ≤ 0,0002). As análises histomorfométrica juntamente com os resultados imuno-histoquímicos para PCNA sugerem que a leptina aumenta a proliferação celular. Em relação à expressão gênica, o tratamento de leptina aumentou a expressão de todos os genes, mas ER-α, em mais de 200 vezes em comparação com a expressão no grupo C. Em conclusão, neste trabalho mostramos que a leptina tem um efeito direto sobre a próstata de ratos adultos levando a um aumento na proliferação celular e na expressão gênica da aromatase, receptor de androgênio, nas isoformas dos receptores de leptina e receptores de estrogênios alfa e beta que são importantes para a fisiologia normal do tecido prostático

O papel da proteína supressora de tumor p53 na indução de ciclooxigenase-2 em Carcinoma de Pulmão de Células Não Pequenas: aspectos moleculares e clínicos

O Carcinoma de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC) é uma doença freqüentemente letal e altamente resistente à terapia oncológica convencional, como por exemplo, o tratamento quimioterápico com cisplatina e paclitaxel. A superexpressão de Ciclooxigenase-2 (COX-2) é constantemente observada em pacientes com NSCLC, estando associada ao prognóstico ruim destes pacientes. Acredita-se que a alta expressão de COX-2 produz efeitos anti-apoptóticos, porém pouco é conhecido sobre os mecanismos de regulação desta enzima. Muitos sinais capazes de ativar COX-2 também induzem a proteína supressora de tumor p53, conhecida pelo seu papel fundamental no controle da proliferação celular e apoptose. Dados recentes indicam que a proteína p53 é um importante regulador da expressão de COX-2. O objetivo desta dissertação foi avaliar os efeitos da quimioterapia na expressão da enzima COX-2 em linhagens celulares com diferente status do gene TP53, e ainda, correlacionar a expressão de COX-2 e o status mutacional de TP53, com as características clínico-patológicas de pacientes com NSCLC. Como ferramentas experimentais foram usadas técnicas de biologia celular e molecular como interferência de RNA, PCR em tempo real, análise mutacional e imuno-histoquímica. Com os resultados obtidos, observamos que as linhagens celulares de câncer de pulmão que apresentam p53 na sua forma selvagem, quando expostas ao tratamento com cisplatina, apresentaram indução da expressão de COX-2 (RNAm e proteína), em adição ao aumento da síntese de Prostaglandina E2 (PGE2). Em contrapartida, a expressão de COX-2 não foi alterada após o tratamento com cisplatina nas linhagens celulares que apresentavam mutação no gene TP53. Ao avaliar o tratamento com paclitaxel, foi observado um aumento da expressão de COX-2 nas linhagens A549 e H460 (linhagens celulares do tipo selvagem para p53), entretanto não foi observada alteração nos níveis de PGE2. Em adição, o tratamento com paclitaxel induziu um aumento da expressão de COX-2 na linhagem com deleção em TP53, ACC LC-319. Em seguida, após silenciamento de p53 na linhagem celular A549, por interferência de RNA, a cisplatina passou a não ser mais capaz de induzir o aumento da expressão de COX-2. No tratamento com paclitaxel, o silenciamento de TP53 não mudou a expressão de COX-2, indicando assim um efeito independente de p53. Dessa maneira, sugerimos que a indução de COX-2, por cisplatina, em linhagens celulares NSCLC é dependente de p53. Na análise dos pacientes NSCLC, os resultados demonstram que 54% dos pacientes apresentam expressão positiva de COX-2. Mutações em TP53 foram observadas em 57% dos pacientes, incluindo 56% de fumantes correntes e 37% de ex-fumantes. Uma associação entre a expressão de COX-2 e o status selvagem de TP53 foi observada, entre os pacientes que apresentaram expressão positiva de COX-2, 80% apresentaram TP53 selvagem. Um número maior de pacientes é necessário para aumentar o poder estatístico e confirmar as tendências observadas nesse estudo

Expressão de marcadores imuno-histoquímicos em biópsias renais de pacientes transplantados

A partir da década de 60, com a utilização do transplante renal em larga escala como terapia substitutiva para pacientes com falência do órgão, surgiu a preocupação quanto ao desenvolvimento do processo de rejeição do enxerto. Tal intercorrência, em geral, cursa com sinais e sintomas clínicos apenas quando o evento está bem estabelecido, ou mesmo quando lesões irreversíveis já se instalaram. Assim, é fundamental um acompanhamento rigoroso, visando detectar os casos subclínicos. O presente trabalho, a fim de fornecer novas ferramentas que auxiliem o diagnóstico precoce de rejeição do enxerto, avaliou a expressão imuno-histoquímica dos anticorpos CD3, CD5, CD20, CD68, CD25, FoxP3 e C4d em biópsias renais realizadas entre os anos de 2007 e 2009 em pacientes transplantados acompanhados pelo Serviço de Nefrologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ - RJ, correlacionando os resultados obtidos com o diagnóstico histológico. Para tal, as biópsias foram reavaliadas por três médicos patologistas que as classificaram, segundo Critérios de Banff 2007, quanto à presença ou não de rejeição do enxerto e seu tipo, aguda ou crônica. A partir de então, os blocos de parafina foram processados pela técnica Tissue Microarray for all (Pires, ARC. e cols.) e submetidos à imuno-histoquímica. A positividade dos marcadores foi avaliada e graduada e os resultados encontrados foram correlacionados, em um primeiro momento, com a presença ou ausência de rejeição. Posteriormente, os casos com diagnóstico histológico de rejeição tiveram seu perfil imuno-histoquímico analisado em função da positividade para C4d, marcador definidor de rejeição humoral. Neste momento, buscou-se averiguar se os anticorpos estudados seriam úteis em detectar, neste grupo, rejeição humoral e celular. Após a análise estatística, realizada pelo Teste Exato de Fisher, pode-se, então, concluir que o comportamento do marcador CD3 é capaz de inferir a presença de rejeição e que os anticorpos CD5 e CD25 permitem sugerir rejeição celular e humoral, respectivamente. Foi observado também que casos sem diagnóstico histológico de rejeição podem apresentar marcação para C4d em mais de 10% de seus capilares peritubulares.

Inibição do receptor de glutamato do tipo NMDA em um modelo de hipóxia-isquemia prenatal: avaliação morfofuncional do cerebelo

Lesões sistêmicas peri e pré-natais alteram o desenvolvimento do SNC, levando a problemas cognitivos e motores em crianças que podem perdurar por toda a vida. Um tipo particular de lesão é a hipóxia-isquemia (HI), caracterizada pela interrupção momentânea ou permanente do fluxo sanguíneo. Um dos mecanismos propostos para as lesões decorrentes da HI é a excitotoxicidade glutamatérgica. O uso de inibidores da neurotransmissão glutamatérgica tem sido estudados em diversos modelos de HI. Neste trabalho, avaliamos os efeitos morfofuncionais da administração de um antagonista não-competitivo do receptor de glutamato NMDA sobre o desenvolvimento do cerebelo. Ratas no 18 dia de gestação foram anestesiadas, os cornos uterinos expostos e as 4 artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo H). Animais controle tiveram os úteros expostos, sem a obstrução (Grupo S). Após a cirurgia a gestação prosseguiu. Somente animais nascidos a termo foram utilizados. Um dia após o nascimento, metade de cada ninhada foi designada para receber MK801, 0,3mg/kg/dia, (grupos SM e HM) e a outra metade recebeu solução salina (grupos SS e HS), por 5 dias. Após anestesia e perfusão-fixação com paraformaldeído 4% aos 9, 23, 30 e 60 dias pós-natais, cortes parassagitais do cerebelo foram obtidos em criótomo e submetidos à imunohistoquímica para calbindina, GFAP, GLAST, PDGFRα e MBP. A partir de 45 dias de vida, os animais foram testados em vários de testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo vazado (CV), ROTAROD, teste de caminhada sobre barras (ladder test) e teste do comprimento da passada (stride length). Aos 9 dias, a espessura da árvore dendrítica era menor nos animais SM, HS/HM, demonstrando efeitos deletérios tanto do MK801 quanto da HI. Menor número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HS/HM, sem efeitos da administração de MK801. Aos 23 dias, maior número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HM comparado aos outros 3 grupos, indicando efeito neuroprotetor do MK801. Nessa idade, menor número de fibras mielinizadas (MBP+) foi observada nos animais HS, e a administração de MK801 parece reverter estes efeitos. Aos 9 dias a distribuição de GLAST estava alterada nos animais HS, com os efeitos da HI parcialmente revertidos pelo MK801. Não foram observados efeitos da HI ou do MK801 sobre comportamentos relacionados a ansiedade pelo LCE, assim como na latência de queda no ROTAROD. HI piora a performance motora no ladder test. No teste do CV, não observamos efeitos da HI sobre a busca por novidade assim como sobre a atividade locomotora espontânea. No entanto, MK801 diminui comportamentos de autolimpeza e a atividade locomotora espontânea. Menor variação das passadas foi observada em decorrência da administração de MK801 no stride length, com nenhum efeito da HI. Nossos resultados demonstram que a inibição do receptor NMDA tem um efeito neuroprotetor sobre os progenitores de oligodendrócitos e mielinização, provavelmente pela manutenção da capacidade proliferativa por um período maior. A atividade do receptor NMDA exerce importante papel na diferenciação das células de Purkinje, assim como na distribuição do transportador GLAST, corroborando a importância deste receptor na gênese das lesões causadas pela HI.

Regeneração do autoimplante esplênico em ratos: avaliação morfofuncional e imuno-histoquímica

Diante da importância do baço, deve-se tentar a sua preservação sempre que possível e, nas situações em que a esplenectomia total é inevitável, a única alternativa para a preservação de sua função parece ser a realização do autoimplante esplênico. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi analisar o desenvolvimento da regeneração morfológica do tecido autoimplantado, sob microscopia de luz e por imunomarcação, e avaliar a regeneração funcional, por meio da depuração dos corpúsculos de Howell-Jolly, em ratos submetidos a esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico. Foram utilizados 112 ratos Wistar albinos machos adultos, distribuídos aleatoriamente em 16 grupos. Semanalmente, durante 16 semanas, os sete animais de cada grupo foram submetidos a coleta sanguínea, sendo preparadas lâminas para avaliação da presença de corpúsculos de Howell-Jolly (avaliação funcional), que estiveram presentes durante as 15 primeiras semanas, sendo que, a partir da oitava semana, houve uma diminuição significativa, mas somente não foram mais identificados na 16 semana. Em seguida à coleta sanguínea, os animais correspondentes a cada semana foram mortos por sobredose anestésica e submetidos a relaparotomia para retirada do tecido esplênico autoimplantado regenerado. Posteriormente, esse tecido regenerado foi analisado sob microscopia de luz, onde, sob coloração de hematoxilina-eosina, observou-se regeneração morfológica completa do tecido autoimplantado a partir da oitava semana, sendo encontrado um tecido morfologicamente idêntico ao baço normal. Com a técnica de resorcina-fucsina de Weigert, identificaram-se fibras do sistema elástico, demonstrando elastogênese intensa no processo de regeneração do tecido esplênico autoimplantado. Na imunomarcação com antígeno de proliferação celular nuclear (PCNA), observou-se proliferação celular, evidenciando uma expressão gradativa das células a partir da 2 semana, sendo que, nas 9 e 10 semanas, observou-se aumento significativo na imunodensidade, quando comparadas às demais, o que não ocorreu com a técnica para caspase-3, onde a apoptose mais intensa ocorreu nas primeiras semanas. Nossos resultados mostram que, com oito semanas, existe regeneração morfológica do autoimplante esplênico, assemelhando-se a um baço normal, no mesmo momento em que parece iniciar-se a sua regeneração funcional.

Defeitos do tubo neural causam alterações estruturais no ureter? Estudo em fetos humanos

Anencefalia é o defeito do tubo neural mais severo. A morfologia do ureter de fetos anencéfalos é desconhecida. O objetivo deste trabalho é analisar a estrutura do ureter de fetos humanos normais e anencéfalos (FHA). Nós estudamos 16 ureteres de 8 fetos sem anomalias congênitas (4 masculinos e 4 femininos) com idades entre 16 e 27 semanas pós concepção (SPC) e 14 ureteres de 7 FHA (4 masculinos e 3 femininos) com idades entre 19 e 33 SPC. Os ureteres foram dissecados e emblocados em parafina. Foram feitos cortes com 5 m e depois corados com Tricrômico de Masson, para quantificação das células de músculo liso (CML) e determinação da área da a luz do ureter, espessura e diâmetro. As amostras também foram coradas com Resorcina Fucsina de Weigert ( para observação das fibras elásticas) e Vermelho de Picro Sirius com polarização e análise imunohistoquímica das fibras do colágeno tipo III. Os dados da quantificação do músculo foram expressos em densidade volumétrica (Vv-%). As imagens foram capturadas com microscópio Olympus BX51 e câmera Olympus DP70. A análise morfológica da área do lúmen, espessura e diâmetro foram feitas usando o software Image J. As médias foram comparadas usando o teste t não pareado (p<0.05). O epitélio do ureter estava bem preservado em ambos os grupos, e não houve diferença entre os grupos. Não observamos fibras do sistema elástico em qualquer ureter analisados. Concentração de músculo liso (Vv) não diferiram significativamente (p = 0,4413) em FHA (12% 1,628) e grupo controle (13,51% 0,9231). A área de luz ureteral foi significativamente menor (p = 0,0341) em FHA (6365μm 1,282), quando comparado ao grupo controle (20,170 5,480 mM). O diâmetro ureteral foi significativamente menor (p = 0,0294) em FHA (166.7μm 10,99) quando comparado ao grupo controle (240 26,6 mM). A espessura ureteral foi significativamente menor (p = 0,0448) em FHA (30.57μm 2,034), quando comparado ao grupo controle (7,453 47.49μm). Colágeno tipo III foi observado em maior quantidade nos ureteres da FHA. Alterações estruturais ureterais nos fetos anencéfalos foram significativas em nosso estudo. O ureter de fetos com anencefalia mostraram mais concentração de colágeno tipo III, menor diâmetro, área e espessura. Nervos ureterais em FHA podem ser modificados devido a lesão cerebral com consequente dano no controle dos nervos ureterais. Isto pode levar a alterações estruturais no ureter de fetos anencéfalos.

Alterações em genes relacionados à via glicolítica em tumores de carcinoma epidermoide de esôfago

O carcinoma epidermoide de esôfago (CEE) representa 90% dos casos de câncer de esôfago no Brasil. O CEE tem detecção tardia, um comportamento extremamente agressivo e baixa sobrevida, sendo, portanto, um alvo interessante para o estudo dos mecanismos envolvidos em sua carcinogênese, a fim de se identificar possíveis alvos terapêuticos ou marcadores moleculares que ajudem na prática clínica. Mudanças no metabolismo energético da célula tumoral parecem ter papel de destaque na transformação maligna. Sabe-se que células tumorais consomem glicose avidamente produzindo ácido lático, mesmo em condições de normóxia. Dentre os fatores que podem contribuir para o estímulo da glicólise em células tumorais destacam-se as alterações em enzimas da via glicolítica tais como: as piruvato-cinases M1 e M2 (PKM1 e PKM2), a hexocinase II (HKII), isofoma 1 do transportador de glicose, GLUT-1, e o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF1α), responsável pela transcrição das proteínas citadas. O objetivo do estudo é avaliar a relação entre a expressão de HIF1α, HK2, PKM2, PKM1 e GLUT-1 e dados clínico-patológicos no CEE. Para tal, foram avaliados tumores conservados em parafina de 44 pacientes com CEE matriculados no INCA e no Hospital das Clínicas de Porto Alegre. Além disso, foram coletadas amostras de biópsia de esôfago em 67 pacientes sem doença esofágica, que foram submetidos à endoscopia no Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE). A expressão das proteínas foi avaliada nos tecidos por imuno-histoquímica, enquanto que a expressão do mRNA de GLUT-1 também foi avaliada nas amostras controle. Foi observado que as amostras controle expressam HK2, PKM1, PKM2, HIF1α nas camadas do epitélio esofágico. Já GLUT-1 e Ki-67 são vistos apenas na camada basal. Além disso, a expressão do mRNA de GLUT-1 não teve correlação com fatores etiológicos da doença. Em CEE a expressão de HK2, PKM2 e GLUT-1 foi vista em todos os tumores, já a expressão de HIF1α e PKM1 foi variável. Além disso, observou-se que maior expressão de HIF-1α apresenta correlação com invasão linfonodal e diferenciação, enquanto que a expressão de HK2 tem relação com sobrevida e PKM1 com diferenciação. As correlações clínicas encontradas sugerem que alterações no metabolismo energético é um alvo de estudo interessante para desenvolvimento de marcadores moleculares que auxiliem a prática clínica.

Efeitos da hipóxia-isquemia perinatal sobre o comportamento motor, distribuição da Tirosina Hidroxilase na substância negra e da NADPH diaforase no hipocampo durante o desenvolvimento em ratos

A hipóxia isquemia (HI) pré-natal é uma das principais causas de mortalidade e doenças neurológicas crônicas em neonatos, que podem apresentar déficits remanentes como: retardamento, paralisia cerebral, dificuldade de aprendizado ou epilepsia. Estes prejuízos, provavelmente, estão relacionados com o atraso no desenvolvimento neural, astrogliose e com a perda de neurônios e oligodendrócitos. Déficits funcionais e cognitivos estão associados à degeneração de vias dopaminérgicas e de estruturas hipocampais. A enzima tirosina hidroxilase (TH) é a enzima limitante na síntese de dopamina e seus níveis são alterados em eventos de HI. O óxido nítrico (NO) é um gás difusível que atua modulando diferentes sistemas, participando de eventos como plasticidade sináptica e neuromodulação no sistema nervoso central e é produzido em grandes quantidades em eventos de injúria e inflamação, como é o caso da HI. O presente estudo teve por objetivos avaliar, utilizando o modelo criado por Robinson e colaboradores em 2005, os efeitos da HI sobre o comportamento motor e avaliar o desenvolvimento de estruturas encefálicas relacionadas a este comportamento como a substância negra (SN) e o complexo hipocampal. A HI foi induzida a partir do clampeamento das artérias uterinas da rata grávida, por 45 minutos no décimo oitavo dia de gestação (grupo HI). Em um grupo de fêmeas a cirurgia foi realizada, mas não houve clampeamento das artérias (grupo SHAM). A avaliação do comportamento motor foi realizada com os testes ROTAROD e de campo aberto em animais de 45 dias. Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P9, P16, P23 e P90, sendo então realizada imunohistoquímica para TH e histoquímica para NADPH diaforase (NADPH-d), para avaliação do NO. Nossos resultados demonstraram redução da imunorreatividade para a TH em corpos celulares na SN aos 16 dias no grupo HI e aumento na imunorreatividade das fibras na parte reticulada aos 23 dias, com a presença de corpos celulares imunorreativos nesta região no grupo HI. Demonstramos também aumento do número de células marcadas para NADPH-d no giro dentado nos animais HI, nas idades analisadas, assim como aumento na intensidade de reação no corno de Ammon (CA1 e CA3) aos 9 dias no grupo HI, e posterior redução nesta marcação aos 23 e 90dias neste mesmo grupo. Nos testes comportamentais, observamos diminuição da atividade motora no grupo HI com uma melhora do desempenho ao longo dos testes no ROTAROD, sem entretanto atingir o mesmo nível do grupo SHAM. Os animais HI não apresentaram maior nível de ansiedade em relação ao grupo SHAM, descartando a hipótese das alterações observadas nos testes de motricidade estarem relacionadas a fatores ansiogênicos. O modelo de clampeamento das artérias uterinas da fêmea se mostrou uma ferramenta importante no estudo das alterações decorrentes do evento de HI pré-natal, por produzir diversos resultados que são similares aos ocorridos em neonatos que passam por este evento.

Uso da S(+) cetamina por via intra-articular em modelo de osteoartrite em ratos: análise da imunoexpressão da ciclooxigenase 2

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa que afeta grande parte da população e resulta em significativa morbidade e incapacidade. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos periféricos da S(+) cetamina na expressão da ciclo-oxigenase 2 (COX-2). Foram utilizados modelos experimentais de osteoartrite em ratos. Inicialmente setenta e dois ratos foram utilizados no estudo. Foram divididos em três grupos de 24 animais cada. Em dois grupos foi induzida a OA através de 2mg de MIA (monoiodo acetato de sódio) por via intra-articular (i.a), em um volume máximo de 50μL e em um dos grupos não foi realizada a indução da OA. No sétimo dia após a indução, dois grupos, incluindo o sem OA, receberam injeção i.a de salina 0,9% em volume máximo de 50μL e o terceiro grupo recebeu injeção de S(+) cetamina na dose de 0,5mg/kg. Nos dias 7, 14, 21 e 28 os animais foram anestesiados e sacrificados para coleta da membrana sinovial e análise imuno-histoquímica da ciclo-oxigenase-2. Durante o estudo ocorreram 29 perdas do material a ser analisado, totalizando um n = 43. O protocolo adotado para a interpretação imuno-histoquímica foi a imunomarcação citoplasmática da COX-2 em células da membrana sinovial, tecido conjuntivo e adiposo, conforme a intensidade da coloração. A análise dos resultados foi realizada através do teste do quiquadrado. A reatividade da COX-2 foi positiva em 53,8% dos animais do grupo sem OA, em 60% do grupo OA com salina e em 80% dos animais do grupo OA com cetamina, sem diferença estatisticamente significante entre os grupos (p = 0,3069). Esse estudo sugeriu que a S(+) cetamina por via intra-articular não inibiu a expressão da COX-2 em modelos de osteoartrite em ratos.

Expressão do interferon-γ em biópsias gengivais de pacientes com periodontite crônica severa

O objetivo desse estudo foi analisar a expressão do interferon-gamma (INF-) em biópsias gengivais de sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite crônica severa. O objetivo secundário foi correlacionar a expressão do INF- no fluido gengival com os sítios onde foram coletadas as biópsias gengivais. Foram coletadas biópsias de 22 pacientes portadores de periodontite crônica generalizada ou localizada severas (idade média 45,5  DP 8,9 anos), sendo 22 sítios profundos e 18 sítios rasos. O grupo controle foi composto por 14 pacientes clinicamente saudáveis (idade média 39,35  DP 16,5 anos). No total, foram 54 biópsias coletadas de 36 pacientes. As amostras do fluido gengival foram coletadas de alguns dos mesmos sítios de onde foram realizadas as biópsias, totalizando 12 sítios profundos, 8 sítios rasos e 4 sítios controle. Foram utilizados os parâmetros clínicos de avaliação de profundidade de bolsa à sondagem (PB); nível de inserção clínica (NIC); índice de placa visível (IPV) e índice de sangramento gengival (ISG). O tecido foi removido com punch de 2 mm de diâmetro, na área cirúrgica (grupo controle) ou na consulta para raspagem subgengival com ou sem acesso cirúrgico (grupo teste) e armazenados em Eppendorffs com 1 ml de solução de formaldeído a 10% para posterior análise morfológica e imuno-histoquímica. A intensidade da marcação do INF- foi avaliada semiquantitativamente nas células epiteliais, plasmócitos, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais, considerando-se marcação forte (escore 2), marcação fraca (escore 1) ou ausência de marcação (escore 0). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar a expressão do INF- nos tecidos epitelial e conjuntivo, entre os três grupos (sítios profundos e rasos da periodontite e sítios controle). Observamos uma tendência a um padrão de marcação similar nos sítios rasos e profundos, com predomínio de marcação fraca nos sítios profundos. Nos sítios controle a marcação do epitélio demonstrou ser predominante. Porém, não foi possível demonstrar diferenças estatisticamente significativas entre a expressão do INF- nos tecidos epitelial e conjuntivo nos grupos analisados. A análise da correlação de Spearman revelou uma forte correlação entre a expressão imuno-histoquímica do INF- no epitélio com macrófagos, fibroblastos e células endoteliais (r ≥ 0,6 e p ≤ 0,01). A expressão do INF- nos tecidos demostrou não ter correlação significante com os dados clínicos apresentados e com o fluido gengival. Concluímos que não foi possível observar diferenças na expressão do INF- em biópsias gengivais nos sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite quando comparados à indivíduos saudáveis, o que pode ser atribuído ao caráter bifásico do INF-. A baixa detecção do INF- no fluido gengival, dentro das limitações do estudo, pode sugerir que este talvez não seja o método de eleição para a detecção do INF-Y.

Óleo de peixe (fonte de ácidos graxos n-3) atenua inflamação das vias aéreas e hiper-reatividade pulmonar induzida por alérgeno em camundongos

O óleo de peixe é rico em ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) n-3 e vem sendo apontado como anti-inflamatório associado à melhora de diversas doenças de natureza inflamatória. No presente estudo, objetivou-se avaliar a influência do óleo de peixe sobre a inflamação pulmonar e hiper-reatividade em camundongos ativamente sensibilizados desafiados com ovoalbumina (OVA). Camundongos A/J machos foram alimentados com dieta standard-chow (SC) ou dieta rica em óleo de peixe (Px) durante 8 semanas. Após 4 semanas do início da dieta, cada grupo foi subdividido aleatoriamente para ser desafiado com salina (SC-SAL e PX-SAL) ou ovoalbumina (SC-OVA e PX-OVA). A função pulmonar (resistência e elastância) foi avaliada através de pletismografia invasiva, na condição de aerolização ou não com metacolina 24 horas após o último desafio antigênico. Foi realizado lavado broncoalveolar (LBA) para contagem de leucócitos e quantificação de eotaxina-2. A deposição de muco e de matriz peribronquiolar e o infiltrado de eosinófilos foram quantificados no tecido pulmonar. Foram avaliados interleucina (IL)-13 através de imunohistoquímica e NFκB, GATA-3 e PPARγ, por western-blotting. O desafio com OVA resultou em aumento da infiltração de eosinófilos, elevada produção de citocinas inflamatórias, remodelamento pulmonar, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas. Detectou-se aumento na expressão dos fatores de transcrição NFκB e GATA-3 nos camundongos do grupo sensibilizado e desafiado com OVA em comparação aos controles. Todas essas alterações foram atenuadas nos camundongos que receberam dieta com óleo de peixe. Expressão elevada de PPARγ foi detectada nos pulmões dos camundongos dos grupos alimentados com óleo de peixe. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ingestão de óleo de peixe atenuou as características clássicas do quadro asmático através da modulação da síntese de mediadores inflamatórios, via regulação negativa de NFκB e GATA-3 e regulação positiva de PPARγ. O óleo de peixe parece ser uma terapia alternativa para o controle e tratamento da asma.